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江苏细胞实验外包了解更多「多图」郎顾之争
2024-03-08 16:00  浏览:48
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细胞实验介绍——流式细胞术检测细胞周期和凋亡

流式细胞术检测细胞周期:

细胞周期:指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程,通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。其检测原理为huo细胞内线粒体中的琥珀酸脱氢酶能催化外源性无色的MTT形成蓝色的结晶Formazan,并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。G0/G1期:有丝分裂发生,细胞分裂成两个细胞,进入下一个细胞周期,或者进入静止期(G0期),而G0期从DNA含量上无法与G1期区分,细胞开始RNA和蛋白质的合成,但DNA含量仍保持二倍体。S期:DNA开始合成,细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。G2期和M期:当DNA成为4倍体时,细胞进入G2期。G2期细胞继续合成RNA及蛋白质,直到进入M期。

PI法是经典的周期检测方法。结果与结论:培养前4d细胞增殖不明显第5~10天迅速增殖,并可见细胞集落及线状结构形成培养第7天的内皮祖细胞具有吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1的功能流式细胞仪检测体外培养第十天的细胞,CD133+细胞占19。PI为插入性核酸荧光染料,能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合,其结合的量与DNA的含量成正比例关系,用流式细胞仪进行分析,就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态,从而计算出各个期的百分含量。

一般流程:细胞收集-70%酒精固定过夜-PI染色-流式细胞仪检测。

细胞凋亡:细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在之前,检测PS的表达,能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,对PS有很高的亲和性,并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理,可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)来区分凋亡和坏死细胞。PI的膜通透性很差,因而只能标记坏死的细胞。

一般流程:细胞收集-PI-AnnexinV标记-流式细胞仪检测。

结果示例:

图 A 细胞周期检测图;B 细胞凋亡检测图

三、自噬过程进行观察和检测

1、观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,因此,直接观察自噬体需在透射电镜下。(5)2000rpm离心15-25min,离心后溶液分4层,吸取中间骨sui基质细胞层(白色浑浊状),PBS洗三次。Phagophore的特征为:新月状或杯状,双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(AV1 )的特征为:双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(AV2 )的特征为:单层膜,胞浆成分己降解。( autophagic vacuolo AV )

2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋 白来示踪自噬形成由于电镜耗时长,不利于监测(Monitoring) 自噬形成,人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。(3)从中间剪断股骨和胫骨,用2ml无菌注she器吸取DMEM/F12溶液冲出gu髓细胞多次,再用针头吹打,吸管吸入离心管内,1000r/min离心5min,弃上清,用PBS重悬细胞。无自噬时,GFP-LC3融合蛋 白弥散在胞浆中;自噬形成时,GFP-LC3融合蛋白转 位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,一个斑点相当于一个自噬体,可以通过计数来评价自噬活性的高低。

3、利用Western Blot检测LC3-II/比值的变化以评价自噬形成自噬形成时,胞浆型LC3 (即 LC3-I)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即LC3-ID,因此,LC3-II/比值 的大小可估计自噬水平的高低。自噬体(AV1)的特征为:双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等。(注意: LC3对LC3-II有更高的亲和力,会造成假阳性。方法2和3需结合使用,同时需考虑溶酶体活性的影响。)

4、MDC (Monodansylcadaverine ,单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体,所有酸性液泡都被染色,故属于非特异性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于双染色,但其能染所有的液泡,故也属于非特异性的。

Q:如何避免中沉淀物的出现?

A:首先要注意正确的解冻步骤,而且溶解过程中一定要每隔一段时间均匀而缓慢的摇动。我们已经发现在下列情况下沉淀物可能增加,使用中应该尽量避免:

(1)热灭活;

(2)在 37℃ 下培养;

(3)反复冻融;

(4)γ 射线照射;

(5)长期储存在 2-8℃;

(6)在室温下放置时间过长

Q:如何去除中的沉淀?

A:如想去除这些絮状沉淀物,可以将分装到无菌离心管中,以 400g 离心,上清液即可直接加入到培养基 内一起过滤。

注意:不要以过滤的方式去除这些絮状沉淀物,因为这可能阻塞滤膜。

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